Дигаплоидные линии получили широкое распространение в селекции овощных культур. Они успешно применяются в селекции белокочанной капусты, брокколи, моркови, тыквенных культур, лука.
Одной из первоначальных задач в селекционном процессе является получение однородного материала, чистых линий.
Применение молекулярных маркеров позволяет существенно сократить время и затраты на этот процесс. Однако высокая степень гомозиготизации все равно требует получения нескольких поколений, что занимает от 6 до 12 лет в зависимости от культуры. К тому же у некоторых культур, например у лука, наблюдается сильная инбредная депрессия, которая не позволяет проводить самоопыление на протяжении нескольких поколений подряд.
Решением этой проблемы является получение дигаплоидных линий.
Гаплоид – это организм, имеющий одинарный набор хромосом. Каждый ген гаплоида представлен одним аллелем. Гаплоидные растения в основном получают из незрелых половых клеток, культивируемых на питательных средах in vitro.
Дигаплоидные линии получают путем удвоения хромосом гаплоидных растений.
Эта технология позволяет за 1-2 года получить растения, гомозиготные по всем генам.
Кроме значительного ускорения селекционного процесса, преимуществом дигаплоидных линий является возможность получения редких рецессивных генов в гомозиготном состоянии, а также увеличение вариантов сочетаний генов.
Технологии получения дигаплоидных линий в настоящее время применяются в большинстве развитых стран мира [7]. Это значительно ускоряет и упрощает ведение селекционного процесса.
Поэтому компания «Гавриш» на базе Крымского селекционного центра оборудовала лабораторию биотехнологии специально для получения дигаплоидных линий различных овощных культур.
При получении дигаплоидных растений необходимо учитывать следующие факторы, которые влияют на образование, развитие и количество регенерантов:
- метод получения гаплоидных растений;
- условия выращивания донорных растений;
- тип экспланта;
- предобработка эксплантов;
- питательная среда и условия культивирования;
- использование различных фитогормонов и их концентраций;
- контроль количества хромосом у получаемых регенерантов;
- метод удвоения гаплоидного набора хромосом;
- условия перевода дигаплоидных растений из культуры in vitro в почву.
Методы получения гаплоидных растений
Существует два метода получения гаплоидных растений:
- использование гаплоиндуктора;
- культура in vitro незрелых пыльников, микроспор и неопыленных завязей и семяпочек.
Метод гаплоиндукции заключается в опылении завязей чужеродной пыльцой
Пыльца, попадая на пестик, прорастает, стимулируя развитие зародыша. Однако в процессе развития чужеродные хромосомы элиминируются, что приводит к образованию гаплоидного зародыша. Этот метод применяется в получении дигаплоидных линий злаковых культур. Сюда можно отнести и опыление гамма-облученной пыльцой. Механизм действия этого метода такой же, как при опылении чужеродной пыльцой. Он успешно применяется в получении гаплоидов огурца и дыни [2, 5, 6, 3, 4].
Второй метод получения гаплоидных растений получил более широкое распространение. Он заключается в культивировании in vitro на искусственных питательных средах незрелых завязей, семяпочек, пыльников и микроспор.
Условия выращивания донорных растений
Необходимым условием высокого выхода гаплоидных эмбриоидов является хорошее состояние материнского растения. Условия его выращивания должны быть оптимальными, иначе частота образования эмбриоидов снижается или вообще отсутствует.
Например, оптимальными условиями выращивания донорных растений лука является хорошо проветриваемая теплица либо климатическая камера с постоянной температурой +14-15ºС [1, 15]. Кроме того, большое значение для культуры in vitro имеет время сбора эксплантов: максимальный выход эмбриоидов наблюдается при срезке бутонов в утренние часы.
Правильный выбор экспланта
В получении гаплоидов через культуру in vitro используют мужской (андрогенез) и женский (гиногенез) гаметофиты. Для индукции андрогенеза культивируют микроспоры или незрелые пыльники, а для индукции гиногенеза – семяпочки или целые завязи. Выбор экспланта зависит от культуры. Так, метод культивирования микроспор и пыльников получил широкое применение в селекции моркови, перца, видов рода Brassica L., а дигаплоиды лука, огурца, тыквы получают при культивировании неопыленных завязей и семяпочек
Предобработка эксплантов
Важным этапом индукции эмбриогенеза является предобработка эксплантов. Собранные бутоны, соцветия или выделенные гаметофиты подвергают кратковременному температурному воздействию, тепловому или холодовому, которое переключает половые клетки с гаметофитного пути развития на спорофитный. Для видов рода Brassica L. успешно используется холодовая предобработка микроспор длительностью 16-48 часов в зависимости от культуры [14].
Питательная среда и условия культивирования селекционных культур
Самыми распространенными питательными средами для андро- и гиногенеза являются среды MS [8], NLN [9], B5 [10], BDS [11]. Для каждой культуры подбирают определенную питательную среду или их комбинацию. Кроме того, существуют сообщения об увеличении индукции эмбриогенеза при использовании половинных концентраций макро-и микросолей, а также при уменьшении доли сахаров.
Условия культивирования эмбриоидов примерно одинаковы для всех культур, это 25ºС при 16-часовой продолжительности дня. Однако у некоторых культур эмбриогенез начинается в темноте, и только сформированные эмбриоиды переносят на свет.
Использование различных фитогормонов и их концентраций в селекции
Подбору регуляторов роста и их концентрации для индукции эмбриогенеза посвящено множество работ.
Для каждой культуры оптимальными считаются определенные фитогормоны
Так, для лука общепринятым является сочетание 2,4-Д (2,4-дихлорфенилуксусная кислота) и 6-БАП (6-бензиламинопурин) в концентрации по 2 мг/л. Для индукции каллусогенеза моркови используется 0,2 мг/л 2,4-Д, а для последующей регенерации проростков – 0,1 мг/л кинетина [16]. Для индукции гиногенеза огурца и тыквы Шмыкова с соавторами [17] рекомендуют сочетание 0,2 мг/л тидиазурона и 0,0001 мкМ эпибрассинолида. А для различных видов рода Brassica L. рекомендуют добавление в питательную среду цитокининов, 2,4-эпибрассинолида и брассинолида [12; 13].
Контроль количества хромосом у получаемых регенерантов
У растений, получаемых через культуру in vitro, набор хромосом может быть как гаплоидным, так и диплоидным – вследствие спонтанного удвоения хромосом.
Кроме того, растения могут быть миксоплоидными: различные клетки одного растения могут содержать разный набор хромосом. Поэтому необходим контроль плоидности получаемых регенерантов.
Он может осуществляться различными способами.
Первый, самый точный и самый быстрый, – это использование проточной цитометрии.
Проточная цитометрия позволяет анализировать большое количество образцов за короткое время, не требует специфичных тканей для анализа, а также большого размера анализируемого образца. Однако этот метод требует дорогостоящего оборудования.
Вторым методом, выявляющим плоидность получаемых регенерантов, является прямой подсчет хромосом.
Метод точный, но довольно долгий, и в селекционном процессе его применить сложно. К тому же подсчитать хромосомы можно только в меристемах корней или верхушечных побегов, что делает этот метод довольно трудоемким. Также отличить гаплоидные растения можно при визуальном осмотре: они меньших размеров и не завязывают семена, – но для этого нужны взрослые, хорошо сформированные растения, а удвоение хромосом обычно проводят у молодых растений или проростков.
Существует также способ определения плоидности по подсчету числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц.
Это довольно простой метод, однако он также проводится на уже взрослых растениях и не позволяет выявлять миксоплоиды. Кроме того, полученные регенерантные растения необходимо анализировать с помощью молекулярных маркеров. Если донорное растение по выбранному гену было гетерозиготным, то у регенерантов анализ должен показать только один аллель. Это позволяет исключить вероятность соматического эмбриогенеза.
Метод удвоения гаплоидного набора хромосом
Самым распространенным методом удвоения хромосом является воздействие на проростки или на меристемы веществами, нарушающими функцию веретена деления. К таким веществам относятся колхицин, α-бромнафталин, оризалин, амипрофос-метил. Они разрушают нити веретена деления, не давая хромосомам расходиться, что приводит к удвоению их числа. Для этого гаплоидные проростки на непродолжительное время помещают в раствор антимитотического агента или воздействуют им непосредственно на меристемы.
Обеспечение максимально комфортных условий при переводе дигаплоидных растений из культуры in vitro в почву
Эта стадия, завершающая в получении дигаплоидных линий, является одной из самых критичных. Растения, выросшие на искусственных питательных средах с постоянной повышенной влажностью, контролируемыми условиями освещения и температуры, при пересадке в почву испытывают большой стресс. Поэтому после пересадки молодым растениям нужно обеспечить максимально комфортные условия. В первое время после пересадки необходимо защитить растения от попадания прямых солнечных лучей, обеспечить повышенную влажность воздуха, отсутствие сквозняков, а также болезней и вредителей.
Проанализировав рынок овощных культур, а также потребности и пожелания потребителя, научные сотрудники лаборатории биотехнологии растений компании «Гавриш» приступили к созданию дигаплоидных линий лука репчатого и огурца. На данный момент получены гаплоидные эмбриоиды лука, которые прошли этап удвоения хромосом и проходят этап укоренения на питательной среде.
Дигаплоидные линии, которые будут получены из этих эмбриоидов, будут использоваться для получения гибридов F1, отвечающих всем современным требованиям.
Библиографический список:
1. Puddephat I.J., Robinson H.T., Smith B.M., Lynn J. Influence of stock plant pretreatment on gynogenic embryo induction from flower bud of onion // Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. – 1999. – № 57. – P. 145-148.
2. Lotfi M., Alan A.R., Henning M.J., Jahn M.M., Earle E.D. Production of haploid and doubled haploid plants of melon (Cucumis melo L.). for use in breeding for multiple virus resistance // Plant Cel Reports. – 2003. – № 21. – P. 1121-112
3. Sun Y. , Mei S., Peng J.et al. Induced haplo plants after pollination by irradiated poll in Cucumis melo L. // Hubei Agricultur Science. – 2006. – № 4. – P. 98-100.
4. Lim W., Earle E.D. Enhanced recovery doubled haploid lines from parthenogene plants of melon (Cucumis melo L.) // Plant Cell Reports. – 2009. – № 98. – P. 351-356.
5. Claveria E., Garcia-Mas J., Dolcet-Sanjuan R. Optimization of cucumber doubled haploid line production using in vitro rescue of in vivo induced parthenogenic embryos // Journal of the American Society for Horticultural Science. – 2005. – № 130(4). – P. 555-560.
6. Xie M., Zhao J., He H., Wu A., Cai R. Induced haploid plants after pollination by irradiated pollen in Cucumis sativus L. // Journal Shanghai Jiaotong University (Agronomy Sciences). – 2005. – №2. – P.45-49.
7. Dunwell J.M. Haploids in fowering plants: origins and exploitation // Plant Biotechnology Journal. – 2010. – № 8. – P. 377-424.
8. Murashige T. , Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. – 1962. – № 15. – P. 473-497.
9. Lichter B. Anther culture of Brassica napus in liquid culture medium // Z. Pfanzenphysiol – 1981. – № 103. – P. 229-237.
10. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells // Experimental Cell Researche. -1968. – № 50. – P. 151-158.
11. Dunstan D.I., Short K. Improved growth of tissue cultures of onion, Allium cepa // Physiologiae Plantarum. — 1977. — № 41. — P. 70-72.
12. Ferrie A.M.R., Dirpaul J., Krishna P., Krochko J., Keller W.A. Effects of brassinosteroids on microspore embryogenesis in Brassica species // In Vitro Cellular & Developmental Biology — Plant. — 2005. — Vol. 41. — P. 742-745.
13. Arnison P.G., Donaldson P., Jackson A., Semple C, Keller W.A. Genotype-specifc response of cultured broccoli (Brassica oleracea var. italica) anthers to cytokinins // Plant Cell, Tissue and Organ Culture -1990. — Vol. 20. — P. 217-222.
14. Gu H.H., Hagberg P., Zhou W.J. Cold
pretreatment enhances microspore embryogenesis in oilseed rape (Brassica napus L.) // Plant Growth Regulation. – 2004 – Vol. 42. – P. 137-143.
15. Монахос, С.Г. Создание чистых линий – удвоенных гаплоидов капусты в культуре изолированных микроспор и селекция F1-гибридов на основе современных методов биотехнологии: метод. Рекомендации / С.Г. Монахос. Москва: Изд-во РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева, 2014. – 44 с.
16. Тюкавин Г.Б. Система биотехнологических методов в селекционной технологии моркови (Daucus carota L.) // Овощи России – 2009. – №1 – С. 17-21.
17. Шмыкова Н.А., Химич Г.А., Коротцева И.Б. Домблидес Е.А. Перспективы получения удвоенных гаплоидов растений семейства Cucurbitaceae L. // Овощи России – 2015. – №3 (28) – С. 28-31.
Коршунова Анастасия Дмитриевна, младший научный сотрудник
